M. Guix Pericas ^1,2, C. Cordón Cardó ^1,2,3, M. A. Cañadas Bouzas ¹, A. Colomer Valero ²,  X. Puig Torrus ^1,2.

¹HISTOPAT S.A. Laboratoris. ²BIOPAT. Biopatologia molecular S.L. Grup Assistència. Barcelona. ³Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Division of Molecular Pathology. Nueva York.

INTRODUCCIÓN

El carcinoma de mama es una de las neoplasias malignas más frecuentes y una de las primeras causas de muerte por cáncer. En la última década se ha incrementado notablemente su detección clínica y radiológica en estadios incipientes, y el diagnóstico de lesiones precursoras. Alrededor del 65% de los casos se diagnostican sin metástasis ganglionares, evolucionando favorablemente un 70% de ellos después del tratamiento quirúrgico, sin terapia coadyuvante 1.

La identificación del 30% restante, que cursará con recidiva o progresión de la enfermedad y podría beneficiarse de tratamientos complementarios (grupo de alto riesgo), no se consigue con los parámetros de pronóstico clásicos y justifica la búsqueda de nuevos factores pronósticos.

En las pacientes con enfermedad avanzada que requieren una selección de terapia complementaria entre opciones diversas, también es esencial disponer de nuevos parámetros capaces de predecir la respuesta al tratamiento.

Entre los factores de pronóstico clásicos para el cáncer de mama, los de mayor significación son el tamaño tumoral y el estado de los ganglios linfáticos axilares. La supervivencia a 5 años varía desde el 45,5% en tumores mayores de 5 cm con metástasis ganglionares hasta el 96,3 % en tumores menores de 2 cm con ganglios indemnes 2.

Otros parámetros de pronóstico que proporciona el estudio morfológico comprenden el grado de diferenciación de la neoplasia y su clasificación.  Es bien conocido que algunos tipos histopatológicos  se caracterizan por un comportamiento menos agresivo que el del carcinoma ductal convencional (carcinoma coloide, tubular, papilar y medular).

En la última década han sido constantes las aportaciones en la literatura de nuevos marcadores de pronóstico, discutiendo su posible utilidad clínica en distintas neoplasias a partir de trabajos experimentales y estudios clínicos.  Las tecnologías implicadas incluyen estudios de fenotipo con técnicas de inmunohistoquímica, detectando productos nucleares o citoplasmáticos relacionados con oncogenes y genes supresores. Técnicas diversas de biología molecular han sido también aplicadas al estudio tisular, analizando directamente el genotipo de la neoplasia.

Aunque se han descrito en la literatura más de 100 posibles factores pronósticos 3-6 , son pocos los que pueden considerarse suficientemente caracterizados o  validados.  En  general, para establecer la utilidad de un marcador de pronóstico, debe validarse tanto en aspectos técnicos como clínicos. La técnica de estudio debe ser suficientemente sensible, específica y reproducible, y los resultados deben ser fácilmente interpretables y significativos para el clínico. Todo ello exige disponer de suficientes estudios clínicos con seguimiento de pacientes, metodología superponible y resultados significativos. El estudio debe identificar un subgrupo de pacientes con probabilidades significativamente diferentes para recurrencia, mortalidad o respuesta al tratamiento, independientemente de otros factores.

En este artículo nos centraremos en los marcadores de pronóstico más importantes y mejor estudiados para el cáncer de mama, susceptibles de formar parte de un panel de pronóstico capaz de predecir la evolución clínica de la neoplasia, incluyendo su respuesta a una pauta terapéutica individualizada.

RECEPTORES HORMONALES

Entre los distintos marcadores de pronóstico para el cáncer de mama con connotaciones de selección de tratamiento,  los receptores de estrógenos (ER) y progesterona (PR) son los de mayor aceptación y aplicación clínica.

Los ER son proteínas intranucleares capaces de enlazar estradiol sérico, efectuando a través de esta interacción un papel esencial en la regulación de la proliferación y diferenciación del epitelio mamario.  El complejo estrógeno-receptor interviene en los mecanismos de división celular y los niveles bajos de estrógenos circulantes se asocian a baja actividad proliferativa tumoral.

Figura 1: Inmunohistoquímica sobre secciones de tejido incluido en parafina. Receptores de progesterona. 95% de positividad nuclear (400 x).

En los últimos 20 años se han publicado numerosos estudios de determinación de ER y PR por método bioquímico (ensayo de unión) en carcinoma de mama que describen positividades del 60-70% y del 45-50% respectivamente 7-12.

En estudios de pacientes sin tratamiento adyuvante, se ha demostrado que la positividad para ER mejora en un 10% el intervalo libre de enfermedad y la tasa de supervivencia,  considerándose un factor de pronóstico favorable y significativo 3.

La razón primordial de estudiar los receptores hormonales es, no obstante, la predicción de respuesta al tratamiento hormonal dirigido a reducir los niveles de estrógenos. Las pacientes con receptores positivos responden al tratamiento en el 50-60% de casos mientras que en pacientes no seleccionadas la respuesta es del 25-30%, y en los casos negativos se reduce a menos del 10%  7,10,13-16 .

Se demuestra una reducción media del 20-30% en recurrencia y mortalidad en las pacientes con ER positivos que reciben tratamiento endocrino y alrededor del 60% de respuesta clínica en pacientes con cáncer avanzado 3,17.

Las técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) para el estudio de los receptores hormonales, recientemente mejoradas, pero aplicadas desde hace más de 10 años, han reemplazado de manera progresiva al método bioquímico clásico.

El ensayo bioquímico determina la actividad de los receptores por milígramo de proteína sobre un homogeneizado tisular y debe efectuarse siempre sobre tejido fresco. La contaminación por tejido normal puede producir resultados “falsos positivos”, siendo una limitación importante de la técnica. Además, se requiere un volumen mínimo de tumor para poder realizar el ensayo, por lo que las neoplasias de pequeño diámetro y carcinomas intraductales no pueden ser analizados. El método IHQ identifica la expresión de los determinantes antigénicos característicos de ER y PR a nivel microanatómico, específicamente en el núcleo celular (FIGURA 1). Esta técnica puede aplicarse sobre tejido fresco, frotis citológicos o tejido fijado e incluido en parafina. Permite, por tanto, estudiar también material de archivo, incluyendo carcinomas diagnosticados en el examen microscópico sin sospecha previa (tumores de pequeño tamaño o intraductales) y metástasis. La evaluación se realiza por visualización directa de preparaciones microscópicas con la posibilidad de examinar simultáneamente el tumor y el tejido normal acompañante, evitando falsos negativos y falsos positivos. En la actualidad disponemos de diversos anticuerpos ampliamente caracterizados para determinar ER y PR por IHQ sobre tejido congelado o incluido en parafina.

Los estudios comparando IHQ con método bioquímico (ensayo de unión) demuestran coincidencia entre ambos del 80-90% para ER y del 70% para PR 3,18.

En nuestros laboratorios (HISTOPAT S.A.) se efectuó un estudio prospectivo de 2.334 casos consecutivos de carcinoma de mama, con detección de receptores de estrógenos y progesterona por método inmunohistoquímico, con resultados superponibles a los de la bibliografía. Un 70,4 % de casos resultaron positivos para ER y un 47,2 % para PR. En un 44,5% fueron positivos ambos receptores y en un 26,8 % fueron ambos negativos (Tabla 1).

	ER POSITIVO	ER NEGATIVO	TOTAL
PR POSITIVO	1.038 (44,5%)	64 (2,7%)	1.102 (47,2%)
PR NEGATIVO	606 (26,0%)	626 (26,8%)	1.232 (52,8%)
TOTAL	1.644 (70,4%)	690 (29,6%)	2.334 (100%)

TABLA 1. Estudio inmunohistoquímico: receptores de estrógenos (ER) y progesterona (PR) en carcinoma de mama (2.334 casos).

Múltiples estudios incluyendo más de 5.000 pacientes, han consolidado el valor pronóstico del método IHQ 9,19-41. En las pacientes sin tratamiento coadyuvante, la positividad con ER se asocia a una mejora del pronóstico del 10 al 15%. 20,28,34,36

En estudios de pacientes con enfermedad avanzada y tratamiento hormonal, alrededor del 70% de los casos ER positivos por IHQ presentan respuesta clínica, mientras que el 85% de los ER negativos no responden 10, 22,29. Estos resultados son superponibles o superiores a los obtenidos con el método bioquímico.

Los PR presentan implicaciones pronósticas similares a los ER para el carcinoma de mama, 3-6 determinándose conjuntamente debido a que proporcionan una mejora en el valor predictivo del método. Estudiando pacientes de cáncer avanzado con ambos receptores 42, la respuesta a terapia endocrina es del 77% si ambos son positivos y sólo del 27% si sólo son positivos los ER. Además, el fenotipo ER negativo/PR positivo, aunque infrecuente, presenta una tasa de respuesta significativamente superior (46%) al negativo con ambos (11%).

A partir de estos estudios, el método IHQ se considera en la actualidad suficientemente validado, con sensibilidad y especificidad equivalentes o superiores a las del ensayo bioquímico clásico, además de poseer una serie de ventajas adicionales, incluyendo su aplicación a muestras de pequeño tamaño y la posibilidad de correlación morfológica simultánea en la evaluación de resultados.

Sin embargo, es importante considerar las condiciones que debe reunir un laboratorio para ofrecer resultados fiables. Se trata de una técnica de metodología compleja que precisa personal técnico experto en IHQ, procedimientos adecuados de validación de resultados, controles de calidad sistemáticos, así como experiencia en la interpretación de los resultados obtenidos.

Antes de considerar implantado el método en un laboratorio concreto, debería validarse técnica y clínicamente, tomando como referencia experiencias previas de centros acreditados con resultados clínicamente significativos 43.

Para la selección de reactivos y técnicas, es indispensable un ensayo sobre un amplio banco de tejidos de fenotipo conocido con distintas metodologías, en busca del protocolo idóneo para cada tipo de muestra y del sistema de cuantificación.

Tanto los anticuerpos disponibles como las metodologías propuestas son múltiples y deben seleccionarse siempre en base a la significación clínica de los resultados.

Un aspecto elemental, pero esencial, es la preservación del tejido desde el momento de su obtención. La aplicación de IHQ sobre tejido fijado y parafinado ofrece resultados excelentes siempre que la fijación tisular y su procesado e inclusión se efectúen correctamente.

La utilización de sistemáticas de laboratorio incorrectas o insuficientemente validadas, así como la interpretación por profesionales con poca experiencia, puede conducir a resultados erróneos y tratamientos inadecuados 43.

 HER-2/neu

El interés por el estudio de las bases moleculares del cáncer ha llevado a la identificación de distintos oncogenes relacionados con los procesos de crecimiento y diferenciación celular, cuya amplificación o sobreexpresión puede influir en el comportamiento de algunas neoplasias malignas. Uno de los más estudiados es el oncogen HER-2/neu, miembro de la familia de receptores de crecimiento celular que incluye al receptor del factor de crecimiento epidérmico. Se ubica en el brazo largo del cromosoma 17 y codifica una proteína de transmembrana de 185 kDa. Descrito inicialmente en neuroglioblastomas inducidos por carcinogénesis en ratas, se ha relacionado posteriormente con distintas formas de cáncer humano 44,45,46,47.

En 1987, Slamon et al 48 describieron la amplificación del gen HER-2/neu en un subgrupo de los 103 casos de carcinoma de mama estudiados, demostrando además su asociación con menor intervalo libre de enfermedad y menor supervivencia. En publicaciones posteriores de los mismos autores 49,50, con series más largas de pacientes, se consolida el valor pronóstico de la amplificación y sobreexpresión del oncogen HER-2/neu.

Por otra parte, trabajos experimentales revelaron la capacidad de inducir carcinoma de mama en ratas mediante la activación específica y selectiva de HER-2/neu 51,52 , así como la posibilidad de inhibir el crecimiento tumoral mediante tratamiento con anticuerpos específicos anti-HER-2/neu. 53 Estos trabajos fueron esenciales para introducir después la hipótesis de aplicación terapéutica en cáncer humano 54,55.

A partir de los trabajos de Slamon y colaboradores 48-50 se han publicado numerosos artículos en los que se confirma la relación significativa entre amplificación del gen o sobreexpresión del producto codificado y mal pronóstico en cáncer de mama. 56,57,58,59,60

Algunos estudios encuentran valor pronóstico sólo en las pacientes con metástasis en ganglios linfáticos 60,61, y otros lo demuestran independientemente del estado ganglionar 62,64 o específicamente en pacientes con ganglios negativos 65.

Se ha establecido también relación entre sobreexpresión de HER-2/neu y otros factores pronósticos, asociándose con receptores hormonales negativos 66,67, tamaño tumoral 67,68, estadío 49, alto grado tumoral 69,70, alta actividad proliferativa 56,70 y DNA aneuploide o tetraploide 70,71.

Aunque los resultados varían significativamente en los diversos estudios publicados, la sobreexpresión del gen se detecta en un 20-30% de casos de carcinoma de mama 49,72,73.

En estudios de correlación con parámetros morfológicos 68,70,74,75 se ha observado que la sobreexpresión de HER-2/neu es muy inferior en los tipos histológicos de bajo grado (carcinomas medular, papilar, tubular y coloide) y en carcinoma lobulillar, que en el carcinoma ductal infiltrante convencional. En cambio, es muy frecuente en enfermedad de Paget y en comedocarcinoma. En estudios de carcinoma intraductal se encuentra frecuente sobreexpresión en el tipo de célula grande y es muy rara en el carcinoma intraductal de célula pequeña, micropapilar o cribiforme. También es muy infrecuente o excepcional en la hiperplasia epitelial ductal, lesiones benignas y epitelio normal.

La mayoría de estudios efectuados con HER-2/neu se han basado en técnicas de IHQ, por la facilidad de aplicación a gran volumen de casos en poco tiempo, incluso de forma retrospectiva. Esta técnica detecta lo que denominamos sobreexpresión, evaluando la proteína producto del gen en la membrana celular (fenotipo) 76-79.

Esta sobreexpresión se acompaña usualmente de amplificación del gen y sólo se encuentran discordancias en un pequeño porcentaje de casos 49,80,81.

La presencia de sobreexpresión sin amplificación puede obedecer en algunos casos a otros mecanismos capaces de alterar la expresión del gen tales como mutaciones o fallos en otros genes reguladores.

El estudio de la amplificación génica (genotipo) requiere técnicas de patología molecular, generalmente más complejas y más difíciles de aplicar en series largas de pacientes. Una excepción a considerar, sin embargo, es la técnica de hibridación “in situ” fluorescente (FISH) que puede realizarse sobre tejido fijado e incluido en parafina y, al igual que la IHQ, permite evaluación morfológica simultánea y los estudios retrospectivos. Esta técnica permite cuantificar la amplificación por examen microscópico (fluorescencia) visualizando el número de copias del gen en el núcleo celular.

Los resultados con FISH han sido validados por comparación con otros métodos 82 y se considera una técnica idónea para estudiar la amplificación de HER-2/neu.

Independientemente del valor pronóstico, distintos estudios demuestran que HER-2/neu es un factor predictivo para respuesta a terapia. La sobreexpresión se ha relacionado con resistencia a citoxano/metotrexate 83,84 y con resistencia a la terapia anti-estrogénica con tamoxifeno 85-87.

En contraste, otros estudios indican que la sobreexpresión de HER-2/neu mejora la respuesta a altas dosis de ciclofosfamida/doxorrubicina/fluorouracilo en las pacientes con ganglios afectados.88

La importancia de este oncogén no se limita, por tanto, a la posibilidad de estratificar a las pacientes en distintos grupos de riesgo sino que es relevante en la toma de decisiones terapéuticas. En este aspecto cabe considerar, además del valor predictivo, la hipotética utilización en un futuro de nuevas estrategias terapéuticas encaminadas a contrarrestar la amplificación de HER-2/neu, como puede ser la utilización de anticuerpos antirreceptor como inmunoterapia, si los estudios en curso confirman su efectividad.

Un último aspecto a considerar es la importancia de la validación de técnicas en los laboratorios. Al igual que sucede con los receptores hormonales, tanto la evaluación de la sobreexpresión por IHQ como las técnicas moleculares que detectan amplificación, deben realizarse únicamente en laboratorios con suficiente experiencia, y previa validación de la metodología, que aseguren resultados fiables.

 P53

En las células humanas las lesiones del DNA se detectan en los puntos de vigilancia (“checkpoints”) del ciclo celular. Estos mecanismos de control determinan una parada temporal en estadíos específicos del ciclo celular que permiten a la célula corregir los posibles errores89. Existen como mínimo dos puntos de vigilancia para monitorizar los defectos del DNA: uno en la transición G1/S (fidelidad en la síntesis de DNA) y el otro en la transición G2/M (fidelidad en la segregación cromosómica). El punto de control en G1 previene la replicación del DNA lesionado, mientras que el de la transición de G2/M se activa cuando la dotación cromosómica está alterada o su segregación es deficiente. Diversos hallazgos han demostrado que el producto del gen supresor P53 es responsable de la actividad del control en G190,91 y observaciones recientes sugieren que también puede jugar un papel regulando la transición de G2/M92,93. Como respuesta a agentes genotóxicos, o en general frente al “stress” celular, se incrementan los niveles de proteína p53 y este aumento determina una parada transitoria de la progresión del ciclo celular en la fase G1. Si no puede repararse la alteración detectada, p53 desencadena la muerte celular activando el proceso de apoptosis y abortando de este modo el ciclo celular y la duplicación de errores genéticos.

En las células sin proteína p53 o en las que está alterada por una mutación, el DNA se replica a partir de un molde dañado generando clonas celulares genéticamente aberrantes de las que pueden desarrollarse clonas malignas. La pérdida de los puntos de control produce además inestabilidad genómica como se demuestra por el aumento en la frecuencia de amplificación génica en células con la p53 defectuosa94,95. Por todos estos hechos, se acepta que la función de la p53 es preservar la integridad del material genético actuando como “guardián del genoma”.

Figura 2: Inmunohistoquímica sobre secciones de tejido incluido en parafina. Proteina p53. 90% de positividad nuclear (100 x).

En la mayoría de formas de cáncer humano se han demostrado mutaciones puntuales del gen P5396-98. Su frecuencia varía según el tipo de neoplasia, pero es del orden del 40-50%99. En general, estas mutaciones se asocian a una pérdida del segundo alelo del gen. En algunos tipos específicos de cáncer, la inactivación de p53 puede conseguirse a través de un mecanismo epigenético100. En el carcinoma de cérvix uterino, en donde la frecuencia de mutación de p53 es muy baja, su inactivación se debe a la asociación con la producción de una proteína oncoviral (E6) por parte del papilomavirus humano, que induce la degradación de la proteína p53. En ciertos tumores, como los sarcomas de tejidos blandos, la sobreexpresión de la proteína celular mdm-2 conduce a una inactivación funcional de la p53 a través de la formación del complejo p53-mdm-2, y se produce una degradación selectiva de p53 similar a la de los productos virales.101

El gen P53 y su proteína pueden estudiarse mediante técnicas de IHQ o moleculares. La IHQ detecta, mediante anticuerpos monoclonales anti-p53, el acúmulo de proteína p53 anómala (usualmente mutada), a nivel nuclear (FIGURA 2). La detección es posible porque la p53 mutada es estable durante 4-12 horas mientras que la normal (“wild-type”) solo es estable durante 15-20 minutos. Las técnicas moleculares (reacción en cadena de la polimerasa, estudios de movilidad en gel y secuenciación) permiten estudiar directamente las alteraciones del gen (mutaciones puntuales, inserciones y deleciones) (FIGURA 3). En el 90% de los casos, la alteración consiste en una mutación puntual que altera un nucleótido de los 23.000 que tiene el gen. Las mutaciones del gen suelen ocurrir en 90 de los 393 codones que se requieren para la síntesis de la proteína. Este alto grado de heterogeneidad hace que el diagnóstico sea complejo porque la región a analizar se extiende aproximadamente a todo el gen.

 Figura 3: PCR-SSCP. Productos de amplificación del exón 8 del gen P53 en dos pacientes (1 y 2). Tinción de plata de gel de acrilamida no desnaturalizante.

(N) tejido normal; (T) tejido tumoral; (M) marcador de peso molecular; (n.d.) producto no desnaturalizado

Las flechas señalan bandas de movilidad anómala (“shifts”) en los productos tumorales respecto al tejido normal.

La IHQ tiene la ventaja de ser más rápida que las técnicas moleculares y permite visualizar directamente el tejido al microscopio identificando las células alteradas. Si bien es verdad que la correlación entre los resultados obtenidos por IHQ y por técnicas moleculares es buena, no es perfecta. La IHQ no puede detectar la acumulación de proteína en casos de mutaciones sin sentido (“nonsense”) productoras de proteínas truncadas, ni cuando aparecen inserciones o deleciones en el gen. Se acepta que con la IHQ puede obtenerse entre un 5 y un 10% de falsos negativos. Por otra parte, existen tumores que pueden presentar sobreexpresión de p53 en ausencia de mutaciones en el gen.

El estudio de p53 puede efectuarse con diversos objetivos:

– Establecer el pronóstico (agresividad biológica de la neoplasia, intervalo libre de enfermedad, sobrevida).

– Estudiar el valor predictivo en relación a la terapia oncológica.

– Posibilidad de discernir entre recurrencia o metástasis de un mismo tumor y un segundo tumor primario.

– Estudiar posibles rasgos hereditarios observando si una mutación es somática o está presente en línea germinal.

– Posible discriminación entre enfermedad benigna y cáncer.

– Estudios de epidemiología molecular asociando ciertas mutaciones con agentes mutágenos específicos.

En este texto nos referiremos exclusivamente a los dos primeros apartados.

 Alteraciones de p53 y valor pronóstico en el cáncer de mama:

La mayoría de los estudios en este campo se han realizado con IHQ. Según la bibliografía, con IHQ se han estudiado aproximadamente 10.000 casos mientras que con técnicas moleculares solamente 3.000 pacientes.

Aunque en general se establece que las neoplasias que expresan p53 alterada se caracterizan por alto grado histológico y biología agresiva, en varios estudios se ha demostrado que las mutaciones de P53 o las alteraciones en la expresión de su producto, son independientes del estadiaje y grado tumoral.

El porcentaje de detección de alteraciones de p53 por IHQ en el cáncer de mama oscila entre el 15 y el 45%102. Estas diferencias pueden ser debidas, en parte, al empleo de distintos anticuerpos o metodologías103.

En relación al carcinoma de mama, diversos estudios correlacionan de manera significativa la sobreexpresión de p53 con peor pronóstico (menor intervalo libre de enfermedad y reducción de la supervivencia)104-110, con ausencia de receptores de estrógenos y con tumores de alto grado histológico105,107,111-123. Algunos autores relacionan la alteración de p53 con peor pronóstico sólo en los casos con ganglios linfáticos positivos124, mientras que en otros trabajos se demuestra correlación en casos de ganglios linfáticos negativos112,121,125.

En nuestros laboratorios (HISTOPAT S.A.), sobre una serie de 830 carcinomas de mama estudiados con IHQ, detectamos expresión alterada de p53 en un 14% (p53 positivos). Comparando estos resultados con los de los receptores hormonales se encuentra mayor incidencia de alteraciones de p53 en los casos negativos para ER y PR (37%) que en los positivos con ambos receptores (5%) (Tabla 2).

	P53 POSITIVO (1)	P53 NEGATIVO	MIB-1 POSITIVO (2)	MIB-1 NEGATIVO
ER+/PR+	18	351	109	102
ER+/PR-	16	217	63	52
ER-/PR+	2	13	2	3
ER-/PR-	79	134	94	21
TOTAL	115	715	268	178

TABLA 2. Estudio inmunohistoquímico: receptores hormonales, actividad proliferativa (MIB-1) y alteraciones de p53 en el carcinoma de mama.

(1) Positividad nuclear ≥ 10%

(2) Positividad nuclear ≥ 20% (alta actividad proliferativa)

Se han realizado estudios comparando los resultados obtenidos por IHQ con los de  técnicas moleculares. Por ejemplo, Berg et al.122 publican un estudio de 316 pacientes con cáncer de mama en las que el estudio molecular demostró un 22% de alteraciones de p53 (70 casos), mientras que con IHQ se detectaron 53 casos. La IHQ no detectó sobreexpresión en 6 casos con mutaciones sin sentido ni en 11 casos con deleción (falsos negativos). Los resultados moleculares alcanzaron significación estadística en relación al pronóstico, a diferencia de los obtenidos por IHQ.

Mediante técnicas moleculares, entre un 12% y un 46% de casos de carcinoma infiltrante de mama presentan mutaciones de P53126, mientras que los estudios de pérdida de heterocigosidad han demostrado que los cambios que se producen en el locus del gen P53 pueden alcanzar hasta un 64% en los tumores de mama127.

Las mutaciones de sentido equivocado (“missense”) afectan con mayor frecuencia a los exones 5-8, lo que se corresponde con las regiones II-V de la proteína. Sin embargo, se ha documentado que hasta un 20% de mutaciones de p53 ocurren fuera de estas regiones128.

La mayoría de estudios en los que se detectaron mutaciones “missense” señalan que la detección de las mismas ofrece información significativa en relación al pronóstico de la enfermedad, principalmente en el grupo de pacientes con ganglios linfáticos negativos. Se establece una asociación entre alteraciones de p53 y reducción de intervalo libre de enfermedad  y  la supervivencia global 121,122,129.

Ciertos estudios han demostrado diferencias entre los grupos de cáncer de mama con ganglios positivos y ganglios negativos en relación al tipo de mutación en el gen P53116,130. Las pacientes con afectación de ganglios axilares tienden a tener más mutaciones en las regiones II y V de la proteína. Estas pacientes tienen un intervalo libre de enfermedad más corto y menor supervivencia, con diferencia estadísticamente significativa, en relación con las pacientes que tienen mutaciones de p53 en las regiones III y IV. Por otro lado, las pacientes sin afectación de ganglios linfáticos axilares presentan con más frecuencia mutaciones de p53 en las regiones III y IV que las pacientes con ganglios afectados. En este grupo, el intervalo libre de enfermedad y la supervivencia fueron similares a los de las pacientes sin mutaciones de p53. Este tipo de estudio sólo puede realizarse mediante técnicas de secuenciación.

Con toda esta información, puede concluirse que la inactivación de la p53 se asocia a un peor pronóstico y a un incremento del riesgo relativo de recidiva aproximadamente en un 1,3-1,5 (30-50%). Un problema a discutir es si ésta diferencia puede considerarse suficientemente relevante para sustentar la decisión clínica de utilizar terapia oncológica adyuvante basándose exclusivamente en el estado de la p53.

Valor predictivo de la p53 en relación a la terapia oncológica:

Probablemente uno de los temas más importantes en relación a p53 y cáncer de mama es su posible relación con la respuesta al tratamiento. La terapia antineoplásica, incluyendo algunos agentes quimioterápicos y la hormonoterapia, actúa por una serie de mecanismos cuya acción final es el fenómeno de la apoptosis131. Este es el mecanismo anti-oncogénico utilizado por los fármacos más comúnmente empleados en la terapia sistémica del cáncer de mama: tamoxifeno y la combinación de ciclofosfamida, metotrexate y 5-fluorouracilo (CMF). Debido a que la p53 es una molécula que modula alguna de las vías de la apoptosis y que las drogas ejercen su efecto terapeútico a través de este mecanismo, se puede intuir que la alteración del estado de la p53 puede traducirse en una resistencia a los fármacos o falta de respuesta al tratamiento.

En estudios de pacientes con receptores de estrógenos positivos y enfermedad diseminada, tratadas con tamoxifeno,132-133 se demuestra una supervivencia inferior (11%) en los casos p53 positivos por IHQ respecto a los negativos (25%).

Las pacientes con cáncer de mama sin afectación ganglionar y con receptores de estrógenos positivos, tratadas con tamoxifeno, presentan intervalo libre de enfermedad significativamente más largo si son p53 negativas comparando con el grupo p53 positivo134-136.

Distintos estudios describen el valor predictivo de p53 en relación con la respuesta al tratamiento con quimio y radioterapia137-140. En pacientes con cáncer avanzado, la respuesta a la doxorubicina es significativamente superior en las pacientes sin mutaciones de p53140. También se ha descrito mayor incidencia de recidivas en las pacientes con mutaciones de p53, tratadas con ciclofosfamida141.

Varios estudios retrospectivos indican que los tumores con mutaciones del gen P53 presentan peor respuesta a la mayoría de agentes citotóxicos comúnmente empleados, así como a la radiación y al tamoxifeno116,140,142-150.

En relación al tratamiento sistémico con CMF, no se han demostrado diferencias significativas dependientes del estado de la p53, en las pacientes sin afectación ganglionar y con receptores de estrógenos negativos151-152.

ACTIVIDAD PROLIFERATIVA

El interés que ha generado en los últimos años la búsqueda de sistemas adecuados para averiguar la actividad proliferativa tumoral ha proporcionado distintos métodos que han permitido establecer su importancia como marcador de pronóstico y su relación con otros parámetros clínico-patológicos.  En general, tanto en el carcinoma de mama como en otras neoplasias, el alto índice proliferativo se asocia a mayor agresividad biológica.

Los métodos clásicos utilizados inicialmente en el estudio de la actividad proliferativa incluyen el recuento mitótico microscópico, con múltiples limitaciones inherentes a su subjetividad, y el marcaje experimental con timidina tritiada y con bromodeoxiuridina . Este último puede ser estudiado actualmente también por IHQ sobre secciones tisulares.

En este apartado nos centraremos en los dos sistemas de mayor utilidad actual, la citometría y la inmunohistoquímica (IHQ), orientada a la detección de antígenos asociados al ciclo celular.

Citometría de flujo y  análisis de imagen:

Estudian el índice proliferativo expresado como el porcentaje de células tumorales con contenido de DNA correspondiente a la fase de síntesis del ciclo celular (fase S)153-161.

La citometría por análisis de imagen estudia parámetros ópticos sobre células tumorales tratadas con tinción de Feulgen, específica para DNA. Los parámetros ópticos son reconvertidos en parámetros informáticos y procesados matemáticamente para elaborar un histograma y un índice de proliferación. Permite seleccionar y evaluar únicamente las células tumorales, desechando las células no neoplásicas acompañantes y es posible aplicarla sobre muestras con representación tumoral escasa. Su inconveniente radica en la lentitud del proceso de evaluación.

La citometría de flujo registra y mide la fluorescencia propia de los ácidos nucleicos reforzada con fluorocromos. Es un método de alta precisión y rapidez pero requiere mayor volumen de muestra que el análisis de  imagen y, por otra parte, no permite discriminar entre células tumorales y otras células acompañantes (estroma tumoral y tejido normal). Este inconveniente origina en algunos casos superposición de poblaciones celulares en los histogramas o contaminación por células diploides normales que dificultan o impiden la obtención de medidas precisas. 162

Inmunohistoquímica:

Se basa en el marcaje pasivo con anticuerpos específicos contra moléculas que intervienen en el ciclo celular. De todas ellas, la mejor estudiada y de mayor aplicación es el  Ki67,  un antígeno nuclear humano de naturaleza proteica no histónica presente en todas las células con actividad proliferativa y ausente en las que no están proliferando163-166. Su síntesis se inicia en la fase G1 del ciclo celular y aumenta durante la fase de síntesis (fase S), alcanzando su máxima expresión al final de la misma según unos autores 167-170 o en las fases G2/M según otros 171-176. Desde que, en 1983, Gerdes et al. colaboradores elaboraron un anticuerpo anti-Ki67 útil en tejido congelado177,178, distintos estudios han consolidado el estudio de IHQ como el método de evaluación más rápido y fidedigno de la actividad proliferativa celular en tumores sólidos 163,179.

Además de su utilidad como marcador de proliferación celular, se ha comprobado también su valor pronóstico 163, 180-183.

El índice de expresión de Ki67 oscila entre el 0% y el 60-80% 181-185 y una positividad igual o superior al 20% se considera indicativa de alta actividad proliferativa y mal pronóstico.

En el carcinoma de mama se ha comprobado su correlación con actividad mitótica elevada 167,181,182,186,187, alto grado histológico 167,181-184,186,188,189 y tendencia a la invasión190. En estudios comparativos de distintos tipos histológicos de carcinoma de mama,  se ha demostrado mayor índice de Ki-67 en los tipos más agresivos y en tumores con valores de p53 elevados 190-192.

Las limitaciones que supone la posibilidad de emplear únicamente tejido congelado se resolvieron a partir de 1993 con la aparición de un nuevo anticuerpo monoclonal , el MIB-1, capaz de detectar Ki-67 en tejido fijado en formol e incluido en parafina, con especificidad comprobada y reactividad superponible al anticuerpo utilizado anteriormente en tejido congelado 166,193. Desde su aparición, el MIB-1 se ha convertido en una herramienta de gran utilidad práctica y ha permitido, además, efectuar numerosos estudios retrospectivos.

En estudios con grupos numerosos de pacientes con carcinoma de mama 194,195 se establece una relación directamente proporcional de los valores de MIB-1 (Ki-67) con tamaño tumoral, ganglios afectados, sobreexpresión de HER-2/neu o p53 e índice de DNA (ploidia), e inversamente proporcional a receptores hormonales.

Otros autores consideran independiente la expresión de Ki-67 de los parámetros pronósticos clásicos (tamaño tumoral y estado ganglionar) 167,181,182,185,186,188,189.

En tumores de tamaño superior a 2 cm con ganglios negativos, la supervivencia es más prolongada si el índice de MIB-1 es inferior al 20%  y en estadíos incipientes de cáncer de mama, los índices proliferativos superiores al 40% aumentan el riesgo de recidiva (16) 196.

La utilización del MIB-1 en el panel de pronóstico del cáncer de mama puede, por tanto, proporcionar información valiosa para el seguimiento clínico y la selección de terapia.

En nuestros laboratorios hemos efectuado un estudio IHQ comparando resultados de  MIB-1 con receptores hormonales en 446 carcinomas de mama y con p53 en 396 casos. Coincidiendo con trabajos de otros autores, encontramos mayor incidencia de alta actividad proliferativa en los tumores ER y PR negativos (82%) que en los positivos (52%) (Tabla 2) y mayor incidencia de alta actividad proliferativa en los carcinomas de mama con alteraciones de p53 (80,5%) que en los p53 negativos (52,7%). (Tabla 3).

	MIB-1 POSITIVO (2)	MIB-1 NEGATIVO	TOTAL
p53 POSITIVO (1)	62	15	77
p53 NEGATIVO	168	151	319
TOTAL	230	166	396

TABLA 3. Estudio inmunohistoquímico: actividad proliferativa (MIB-1) y alteraciones de p53 en el carcinoma de mama.

(1) Positividad nuclear ≥ 10%

(2) Positividad nuclear ≥ 20% (alta actividad proliferativa)

El estudio del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) con el anticuerpo PC10, considerado hasta hace pocos años como equivalente al de Ki-67 y todavía utilizado en algunos laboratorios, se considera actualmente poco fiable por su escasa especificidad. Detecta un epítopo simple y reconoce, no solamente otras proteínas nucleares similares, sino también formas de PCNA no nucleosómicas y no asociadas, por tanto, a la síntesis activa de DNA 197. Se ha comprobado, además, que el porcentaje de positividad varía en función del tiempo de fijación tisular y resulta en índices de PCNA virtuales, generalmente superiores al real 197.

Aunque en los últimos años se han propuesto nuevos marcadores de proliferación celular, la mayoría todavía en estudio (Ki-S5198, topoisomerasa II199, histona H3195, mitosina195), el MIB-1 sigue siendo el método de elección.

 MICROMETASTASIS

Como se ha comentado anteriormente, el pronóstico y tratamiento de las pacientes con cáncer de mama está altamente influenciado por la existencia de metástasis en los ganglios axilares, que se establece en el estudio macro y microscópico de la pieza quirúrgica. El hecho de que un 30% de las pacientes en las que no se detectan metástasis ganglionares presenten progresión de la enfermedad, justifica el empleo de metodologías adicionales de estudio en busca de poblaciones celulares metastáticas poco representadas y no detectables en el examen microscópico convencional (micrometástasis).

Con esta finalidad se ha propuesto, para los casos con ganglios negativos, un estudio inmunohistoquímico con anticuerpos anti-queratinas de distinto peso molecular u otros marcadores epiteliales, sobre secciones seriadas de todos los ganglios disecados.

Con este método, distintos autores detectan micrometástasis entre los casos negativos en el estudio histopatológico inicial, en porcentajes que varían del 9 al 20% 200-202. Estos casos constituyen un subgrupo con mayor riesgo de progresión. En un estudio de 921 casos de carcinoma de mama se establece una reducción del 15% en la supervivencia a 6 años para estas pacientes 200.

Esta metología de estudio resulta también esencial en el contexto de las nuevas estrategias quirúrgicas recientemente propuestas, basadas en el estudio del ganglio centinela 203.

Un método inmunohistoquímico similar para detectar micrometástasis en la médula ósea permite la predicción de recurrencia en estadíos iniciales de cáncer de mama y la evaluación y seguimiento de la respuesta a quimioterapia en estadíos avanzados 204-205.

 OTROS FACTORES DE PRONOSTICO

En los apartados anteriores nos hemos centrado en los factores pronósticos que han suscitado mayor interés en los últimos años, que han sido objeto de gran número de publicaciones y líneas de investigación en cáncer de mama y que pueden aportar información valiosa, complementando los parámetros clásicos de pronóstico.

Existe, sin embargo, una larga lista de posibles factores de pronóstico propuestos, tanto para el carcinoma de mama como para otras múltiples formas de cáncer (catepsina D, proteína pS2, MDR, gen del retinoblastoma, receptor del factor de crecimiento epidérmico, bcl-2, ciclina D1, estudios de angiogenesis, ploidia …).

Algunos de ellos han sido muy discutidos y, en su mayoría, deben ser estudiados con mayor profundidad antes de establecer su validación clínica.

La catepsina D es una proteasa lisosomal acídica presente en los tejidos normales que está sobreexpresada en algunos carcinomas de mama, interviene en los procesos de invasión y metástasis y algunos estudios la relacionan con mayor agresividad tumoral 206,207. Su utilidad, sin embargo, ha sido muy controvertida, su valor pronóstico es dudoso y existen serias discordancias en los criterios de evaluación de resultados.

La proteína pS2 está relacionada con el nivel de estrógenos y, aunque sus funciones son poco conocidas, se halla frecuentemente sobreexpresada en carcinomas de mama con ER positivos y algunos estudios la asocian a mayor supervivencia y buena respuesta a la terapia endocrina 208.

El gen MDR (gen de resistencia a múltiples drogas) codifica una glicoproteina de membrana (glicoproteína P) presente en endotelios normales con función de barrera natural sangre-tejido, en los epitelios secretores o excretores y en las células trofoblásticas. Su sobreexpresión en las neoplasias se asocia al fenómeno de resistencia a múltiples agentes quimioterápicos 209,210.

El gen del retinoblastoma, ubicado en el cromosoma 13, es, como el gen P53, un gen supresor con funciones esenciales en el control del ciclo celular. Descrito inicialmente en casos de retinoblastoma ocular, se ha relacionado posteriormente con diversas formas frecuentes de cáncer y algunos autores han asociado alteraciones en su patrón de expresión con el pronóstico del cáncer de mama 211.

El gen bcl-2 (oncoproteína t(14;18)), ubicado en el cromosoma 18, está implicado en el control del mecanismo de muerte celular programada (apoptosis) y, además de su utilidad diagnóstica en algunos tipos de linfoma, se ha relacionado también con el pronóstico del carcinoma de mama 212.

La Ciclina D1 interviene en la iniciación del ciclo celular en la fase G1 y se considera un marcador incipiente de activación celular. Su amplificación y, fundamentalmente, su sobreexpresión, se ha asociado con mal pronóstico en el cáncer de mama en publicaciones recientes 213,214 y es objeto de líneas de investigación en curso.

Si bien la actividad proliferativa, como ya hemos comentado, tiene valor pronóstico reconocido en múltiples neoplasias, la utilidad del estudio de la ploidia es muy dudosa. Mientras que algunos estudios han atribuido comportamiento más agresivo a los carcinomas de mama con dotación anómala de DNA (tetraploides y aneuploides) que a los que conservan su dotación normal (diploides), otros ponen en duda el valor pronóstico del estudio de la ploidia 215,216.

CONCLUSIONES

La alta incidencia del carcinoma de mama y las limitaciones de los parámetros clásicos de pronóstico para estratificar las pacientes en grupos de distinto riesgo de progresión y sustentar decisiones terapéuticas, han llevado en la última década a múltiples estudios de nuevos factores pronósticos.

En las pacientes en estadío inicial de cáncer de mama, los parámetros morfológicos clásicos son incapaces de discriminar el 30% de los casos que evolucionarán desfavorablemente y que serían susceptibles de tratamiento sistémico adyuvante. Por otra parte, la toxicidad de esta terapia impide su aplicación indiscriminada.

En las pacientes con neoplasias avanzadas, también es esencial disponer de nuevos criterios de selección de terapia. Las respuestas al tratamiento hormonal o a la quimioterapia no son uniformes ni totalmente predecibles a partir de criterios morfológicos y del estado de los receptores hormonales.

La conjunción del estudio clínico-patológico con nuevas técnicas de inmunohistoquímica y biología molecular, permite profundizar en el conocimiento del fenotipo y del genotipo de las neoplasias y su correlación con la evolución biológica.

Entre los distintos marcadores pronósticos se encuentran oncogenes cuya amplificación o sobreexpresión se relaciona con mayor agresividad tumoral (HER-2/neu, Ciclina D1 ..) y genes supresores como el gen P53 y el del retinoblastoma, con funciones críticas en el control del ciclo celular, cuyas alteraciones se asocian también a neoplasias más agresivas.

Muchas revisiones recientes coinciden en destacar aspectos controversiales en distintos factores pronósticos, recomiendan estudios con series largas de pacientes, con metodologías unificadas y establecen criterios estrictos para validar un factor pronóstico, basados en la correlación clínica.

El análisis global de las múltiples publicaciones disponibles refleja, sin embargo, diferencias notables entre distintos marcadores y permite conceder relevancia a los que han sido objeto de mayor número de estudios con coincidencia de resultados. En esta revisión hemos dedicado especial atención a este grupo de factores pronósticos (ER, PR, HER-2/neu, p53, Ki67), capaces de reforzar la información disponible por los parámetros clásicos (tamaño tumoral, estado ganglionar, tipo histológico y grado de diferenciación) y susceptibles, por tanto, de configurar un nuevo panel de pronóstico para el cáncer de mama.

En lo referente a los receptores hormonales (ER, PR) se ha destacado la importancia del método de detección inmunohistoquímico, totalmente validado en la actualidad, y con notables ventajas respecto al método bioquímico (ensayo de unión).

La gran mayoría de estudios disponibles sobre HER-2/neu y p53 les atribuyen, además de valor pronóstico influenciando sobre el intervalo libre de enfermedad y la supervivencia global, valor predictivo esencial en la selección de terapia adyuvante. Ambos marcadores se han relacionado con mala respuesta al tratamiento con tamoxifeno y regímenes específicos de quimioterapia.

Un aspecto a enfatizar, finalmente, es la necesidad de unificación metodológica, tanto en estudios de investigación como en aplicaciones asistenciales. En lo referente a HER-2/neu y p53, son necesarios más estudios de correlación entre distintas técnicas para establecer la metodología de estudio de elección (inmunohistoquímica frente a técnicas de biología molecular). En este aspecto cabe considerar, además de la sensibilidad y la especificidad, la facilidad de aplicación y las limitaciones de las distintas técnicas.

Tanto las técnicas de inmunohistoquímica como las de biología molecular, requieren personal técnico cualificado con experiencia prolongada, metodologías complejas, sistemas rigurosos de validación de técnicas y control de calidad sistemático, para garantizar resultados fiables. La interpretación de los resultados deben efectuarla profesionales con formación en patología y en inmunopatología y con experiencia en marcadores tumorales. Algunas de las discrepancias entre distintos trabajos de investigación son atribuibles a diferencias metodológicas y, en la práctica asistencial, los errores de laboratorio se traducen en errores terapéuticos.

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